PCR, è la reazione a catena della polimerasi, che si riferisce all'aggiunta di dNTP, Mg2+, fattori di allungamento e fattori di potenziamento dell'amplificazione al sistema sotto la catalisi della DNA polimerasi, utilizzando il DNA genitore come modello e primer specifici come punto di partenza dell'estensione, Attraverso le fasi di denaturazione, ricottura, estensione, ecc., il processo di replicazione in vitro del DNA del filamento figlia complementare al DNA modello del filamento genitore può amplificare rapidamente e in modo specifico qualsiasi DNA bersaglio in vitro.
1. PCR con avvio a caldo
L'ora di inizio dell'amplificazione nella PCR convenzionale non è quella di inserire la macchina PCR nella macchina PCR, quindi il programma inizia ad amplificare.Una volta completata la configurazione del sistema, inizia l'amplificazione, che potrebbe causare un'amplificazione non specifica e la PCR hot-start può risolvere questo problema.
Che cos'è la PCR hot start?Dopo che il sistema di reazione è stato preparato, il modificatore enzimatico viene rilasciato ad alta temperatura (solitamente superiore a 90°C) durante la fase di riscaldamento iniziale della reazione o fase di “hot start”, in modo che la DNA polimerasi venga attivata.Il tempo e la temperatura esatti di attivazione dipendono dalla natura della DNA polimerasi e dal modificatore di hot-start.Questo metodo utilizza principalmente modificatori come anticorpi, ligandi di affinità o modificatori chimici per inibire l'attività della DNA polimerasi.Poiché l'attività della DNA polimerasi è inibita a temperatura ambiente, la tecnologia hot start offre grande comodità per preparare più sistemi di reazione PCR a temperatura ambiente senza sacrificare la specificità delle reazioni PCR.
2. RT-PCR
RT-PCR (PCR a trascrizione inversa) è una tecnica sperimentale per la trascrizione inversa dall'mRNA al cDNA e per utilizzarlo come modello per l'amplificazione.La procedura sperimentale consiste nell'estrarre prima l'RNA totale nei tessuti o nelle cellule, utilizzare Oligo (dT) come primer, utilizzare la trascrittasi inversa per sintetizzare il cDNA e quindi utilizzare il cDNA come modello per l'amplificazione PCR per ottenere il gene bersaglio o rilevare l'espressione genica.
3. PCR quantitativa fluorescente
PCR quantitativa fluorescente (PCR quantitativa in tempo reale,RT-qPCR) si riferisce al metodo di aggiunta di gruppi fluorescenti al sistema di reazione PCR, utilizzando l'accumulo di segnali fluorescenti per monitorare l'intero processo PCR in tempo reale e infine utilizzando la curva standard per analizzare quantitativamente il modello.I metodi qPCR comunemente usati includono SYBR Green I e TaqMan.
4. PCR annidata
La PCR annidata si riferisce all'uso di due set di primer PCR per due cicli di amplificazione PCR e il prodotto di amplificazione del secondo ciclo è il frammento del gene bersaglio.
Se un disadattamento della prima coppia di primer (primer esterni) provoca l'amplificazione di un prodotto non specifico, la possibilità che la stessa regione non specifica venga riconosciuta dalla seconda coppia di primer e continui ad amplificarsi è molto piccola, quindi il amplificazione mediante la seconda coppia di primer, la specificità della PCR è stata migliorata.Un vantaggio di eseguire due cicli di PCR è che aiuta ad amplificare una quantità sufficiente di prodotto da un DNA iniziale limitato.
5. PCR di contatto
Touchdown PCR è un metodo per migliorare la specificità della reazione PCR regolando i parametri del ciclo PCR.
Nella PCR touchdown, la temperatura di ricottura per i primi cicli è impostata alcuni gradi al di sopra della temperatura massima di ricottura (Tm) dei primer.Una temperatura di ricottura più elevata può ridurre efficacemente l'amplificazione non specifica, ma allo stesso tempo, una temperatura di ricottura più elevata aggraverà la separazione dei primer e delle sequenze target, con conseguente riduzione della resa della PCR.Pertanto, nei primi cicli, la temperatura di ricottura viene solitamente impostata per diminuire di 1°C per ciclo per aumentare il contenuto del gene bersaglio nel sistema.Quando la temperatura di ricottura viene abbassata alla temperatura ottimale, la temperatura di ricottura viene mantenuta per i cicli rimanenti.
6. PCR diretta
La PCR diretta si riferisce all'amplificazione del DNA target direttamente dal campione senza la necessità di isolamento e purificazione dell'acido nucleico.
Esistono due tipi di PCR diretta:
metodo diretto: prelevare una piccola quantità di campione e aggiungerlo direttamente alla PCR Master Mix per l'identificazione tramite PCR;
metodo di cracking: dopo aver campionato il campione, aggiungerlo al lisato, lisare per rilasciare il genoma, prendere una piccola quantità di surnatante lisato e aggiungerlo alla PCR Master Mix, eseguire l'identificazione tramite PCR.Questo approccio semplifica il flusso di lavoro sperimentale, riduce il tempo necessario ed evita la perdita di DNA durante le fasi di purificazione.
7. PCR SOE
Lo splicing genico mediante PCR con estensione sovrapposta (SOE PCR) utilizza primer con estremità complementari per far sì che i prodotti della PCR formino catene sovrapposte, in modo che nella successiva reazione di amplificazione, attraverso l'estensione delle catene sovrapposte, diverse fonti della tecnica A in cui i frammenti amplificati siano sovrapposti e giuntati insieme.Questa tecnologia ha attualmente due principali direzioni di applicazione: costruzione di geni di fusione;mutazione sito-diretta del gene.
8. IPCR
La PCR inversa (IPCR) utilizza primer complementari inversi per amplificare frammenti di DNA diversi dai due primer e amplifica sequenze sconosciute su entrambi i lati di un frammento di DNA noto.
L'IPCR è stato originariamente progettato per determinare la sequenza di regioni sconosciute adiacenti e viene utilizzato principalmente per studiare le sequenze dei promotori dei geni;riarrangiamenti cromosomici oncogenici, come fusione genica, traslocazione e trasposizione;e l'integrazione dei geni virali, sono ora comunemente usati. Per la mutagenesi sito-diretta, copiare un plasmide con la mutazione desiderata.
9. dPCR
La PCR digitale (dPCR) è una tecnica per la quantificazione assoluta delle molecole di acido nucleico.
Attualmente esistono tre metodi per la quantificazione delle molecole di acido nucleico.La fotometria si basa sull'assorbanza delle molecole di acido nucleico;La PCR quantitativa fluorescente in tempo reale (Real Time PCR) si basa sul valore Ct e il valore Ct si riferisce al numero di cicli corrispondente al valore di fluorescenza che può essere rilevato;la PCR digitale è la più recente tecnologia quantitativa basata sul metodo PCR a molecola singola per il conteggio. La quantificazione dell'acido nucleico è un metodo quantitativo assoluto.
Orario di pubblicazione: 13 giugno 2023