Utilizzo e precauzioni della provetta per centrifuga per ultrafiltrazione
1) Scegliere un tubo di ultrafiltrazione adatto.Si noti che le membrane UF differiscono nel loro livello di tolleranza a vari prodotti chimici.Tipicamente, i tubi di ultrafiltrazione con un limite di peso molecolare di 10 kDa possono essere selezionati con un limite di peso molecolare che non deve essere superiore a 1/3 del peso molecolare della proteina di interesse, ad esempio 35 kDa.Se il peso molecolare della proteina di interesse è di circa 10 kd, è possibile utilizzare un tubo di ultrafiltrazione con un cut-off di peso molecolare di 3 Kd.
(2) L'ultrafiltrazione, appena acquistata, è a secco, con acqua ultrapura aggiunta prima dell'uso e acqua completamente fatta passare attraverso la membrana, il bagno di ghiaccio o il frigorifero preraffreddato per alcuni minuti.Quindi si versa l'acqua, cioè il liquido proteico, e la quantità che se ne aggiunge, a seconda di quale non sia superiore alla linea bianca nella parte superiore del tubo.L'operazione è leggera e il tubo di ultrafiltrazione deve essere preraffreddato su ghiaccio prima di aggiungere la soluzione proteica.
3) Sia la massa che il baricentro dovevano raggiungere l'equilibrio.Si noti che la velocità di rotazione e l'accelerazione non sono molto elevate, altrimenti danneggerebbero direttamente la membrana di ultrafiltrazione.È stata avviata l'ultrafiltrazione centrifuga (centrifuga preraffreddata a 4 gradi).Dopo che l'RPM delle diverse centrifughe è stato convertito in g, era diverso.L'accelerazione della centrifuga è stata regolata al minimo, riducendo la pressione sulla membrana.Nota, assicurati di lasciare la centrifuga dopo che la centrifuga ha raggiunto la velocità di destinazione, altrimenti, se hai un problema, non puoi gestirlo per la prima volta.L'orientamento della membrana rispetto al mandrino è stato regolato secondo le istruzioni (la custodia della centrifuga angolare è perpendicolare alla membrana rispetto all'asse).Nell'uso pratico, la velocità di rotazione generale è inferiore a quella indicata nelle istruzioni, in modo da poter prolungare la durata della provetta da centrifuga.
3) Sia la massa che il baricentro dovevano raggiungere l'equilibrio.Si noti che la velocità di rotazione e l'accelerazione non sono molto elevate, altrimenti danneggerebbero direttamente la membrana di ultrafiltrazione.È stata avviata l'ultrafiltrazione centrifuga (centrifuga preraffreddata a 4 gradi).Dopo che l'RPM delle diverse centrifughe è stato convertito in g, era diverso.L'accelerazione della centrifuga è stata regolata al minimo, riducendo la pressione sulla membrana.Nota, assicurati di lasciare la centrifuga dopo che la centrifuga ha raggiunto la velocità di destinazione, altrimenti, se hai un problema, non puoi gestirlo per la prima volta.L'orientamento della membrana rispetto al mandrino è stato regolato secondo le istruzioni (la custodia della centrifuga angolare è perpendicolare alla membrana rispetto all'asse).Nell'uso pratico, la velocità di rotazione generale è inferiore a quella indicata nelle istruzioni, in modo da poter prolungare la durata della provetta da centrifuga.
(4) Una volta concentrati sui rimanenti 1 ml, prendere 50 ul di soluzione tampone, aggiungere 10 ul di flusso e vedere se c'è qualche colore blu, come giudizio se nel tubo di ultrafiltrazione mancano proteine.Se il tubo perde, versare nuovamente lo strato superiore e farlo scorrere in un nuovo tubo per avviare l'ultrafiltrazione.Per determinare con precisione se sono state saltate le provette, centrifugare per 10 minuti con 5 mg ml di BSA prima del flusso, utilizzando colla proteica o test Bradford grezzo, e continuare aggiungendo la restante soluzione proteica concentrata (che funziona su ghiaccio e impedisce alle proteine di riscaldarsi) fino a quando è stato aggiunto tutto il concentrato.Fare attenzione durante la centrifugazione se si verifica la precipitazione delle proteine, con conseguente chiusura della provetta.Se si verifica una precipitazione, determinare se la causa specifica della precipitazione è un'eccessiva concentrazione proteica o un tampone inappropriato;Il primo può essere risolto mediante ultrafiltrazione di più tubi di ultrafiltrazione contemporaneamente, diminuendo la concentrazione, e il secondo scambiando diverse soluzioni tampone fino a quando non si verifica alcuna precipitazione della proteina.
(4) Una volta concentrati sul restante 1 ml, prendere 50 ul di soluzione tampone, aggiungere 10 ul di flusso e vedere se c'è qualche colore blu, come giudizio se nel tubo di ultrafiltrazione mancano proteine.Se il tubo perde, versare nuovamente lo strato superiore e farlo scorrere in un nuovo tubo per avviare l'ultrafiltrazione.Per determinare con precisione se sono state saltate le provette, centrifugare per 10 minuti con 5 mg ml di BSA prima del flusso, utilizzando colla proteica o test Bradford grezzo, e continuare aggiungendo la restante soluzione proteica concentrata (che funziona su ghiaccio e impedisce alle proteine di riscaldarsi) fino a quando è stato aggiunto tutto il concentrato.Fare attenzione durante la centrifugazione se si verifica la precipitazione delle proteine, con conseguente chiusura della provetta.Se si verifica una precipitazione, determinare se la causa specifica della precipitazione è un'eccessiva concentrazione proteica o un tampone inappropriato;Il primo può essere risolto mediante ultrafiltrazione di più tubi di ultrafiltrazione contemporaneamente, diminuendo la concentrazione, e il secondo scambiando diverse soluzioni tampone fino a quando non si verifica alcuna precipitazione della proteina.
(5) I primi passaggi vengono utilizzati per concentrare la proteina e, se è necessario modificare il tampone, aggiungere delicatamente il nuovo tampone (ultrafiltrazione attraverso una membrana di ultrafiltrazione da 0,22 um) a circa 1 ml di proteine totali e riconcentrare a circa 1 ml per tre volte consecutive, con il volume finale concentrato finale che dipende dalla concentrazione proteica desiderata, generalmente non superiore a 500 ul, ma anche entro 200 ul.Raggiungere 1000 × o più in tre occasioni, essenzialmente la stessa variazione del buffer, calcolata ogni volta con almeno 10 × circa l'arricchimento del volume.
(5) I primi passaggi vengono utilizzati per concentrare la proteina e, se è necessario modificare il tampone, aggiungere delicatamente il nuovo tampone (ultrafiltrazione attraverso una membrana di ultrafiltrazione da 0,22 um) a circa 1 ml di proteine totali e riconcentrare a circa 1 ml per tre volte consecutive, con il volume finale concentrato finale che dipende dalla concentrazione proteica desiderata, generalmente non superiore a 500 ul, ma anche entro 200 ul.Raggiungere 1000 × o più in tre occasioni, essenzialmente la stessa variazione del buffer, calcolata ogni volta con almeno 10 × circa l'arricchimento del volume.
Orario di pubblicazione: 09-nov-2022